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Establecimiento de un cultivo en suspensión del musgo Polytrichum juniperinum y evaluación de su potencial para la producción de compuestos bioactivos

Ruíz Molina, Natalia (2015) Establecimiento de un cultivo en suspensión del musgo Polytrichum juniperinum y evaluación de su potencial para la producción de compuestos bioactivos. Maestría thesis, Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín.

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Resumen

Resumen: El tejido protonemal de musgos en suspensión ha sido reconocido como una plataforma deseable de producción de proteínas recombinantes debido a sus notables ventajas. Sin embargo, actualmente hacen falta estudios en donde se evalúe su potencial para la producción de metabolitos de alto valor agregado. En esta tesis se estableció por primera vez un cultivo de tejido protonemal de Polytrichum juniperinum y se evaluaron los efectos del medio de cultivo basal, condiciones tróficas, pH inicial, tamaño del inóculo, longitud de onda de la luz y la disrupción mecánica del tejido sobre su crecimiento, con el propósito de mejorar la bioproductividad del cultivo. Además se realizó un análisis fitoquímico y se evaluó la actividad antibacteriana y citotóxica del protonema creciendo en suspensión, como evidencia de la producción de compuestos bioactivos de alto valor. La tasa específica de crecimiento máxima y el contenido de compuestos fenólicos no presentó diferencias entre los medios MS, Knop, PPNH4, aunque si se observó un efecto sobre la diferenciación del tejido. El protonema mostró capacidad para crecer en suspensión en condiciones mixotróficas y heterotróficas utilizando sacarosa como fuente de carbono orgánico, sin necesidad de una adaptación previa del tejido. Se observó un aumento de tres veces en la tasa específica de crecimiento en condiciones mixotróficas, alcanzando densidades celulares elevadas (11 g/L) y se evidenció la secreción de azúcares simples al medio durante la fase exponencial de crecimiento. Por otra parte, este estudio demostró que el protonema de P. juniperinum es tolerante a un amplio intervalo de pH inicial (4.5 a 8) cuando se cultiva en medio MS. Bajo condiciones mixotróficas y fotoautotróficas el aumento en el tamaño del inóculo de 45 mg/L a 300 mg/L resultó en una disminución del índice de crecimiento, contrario a las condiciones heterotróficas en las cuales no se encontraron diferencias entre los diferentes tamaños de inoculo evaluados. El uso de diferentes concentraciones de sacarosa no afectó el crecimiento del protonema, sin embargo si generó un efecto sobre la diferenciación del tejido, como un efecto combinado con el tamaño del inóculo. En adición, se encontró que la variación en la longitud de onda de la luz afecta notablemente el crecimiento del protonema en suspensión de P. juniperinum, obteniéndose un índice de crecimiento significativamente mayor para el espectro de luz azul o blanco seguido por el rojo, verde o amarillo y oscuridad en condiciones fotoautotróficas. Esta variación también tuvo efectos sobre la composición de la biomasa, encontrándose un mayor contenido de clorofilas, carotenoides y terpenoides totales en los cultivos expuestos a luz blanca y un menor contenido en aquellos expuestos a luz azul, aunque no se encontraron diferencias significativas en el contenido de compuestos fenólicos totales entre ellos. Finalmente, la disrupción mecánica del tejido durante 15 y 60 segundos indujo un estallido oxidativo temporal que a su vez podría tener un efecto directo sobre la activación del metabolismo secundario, evidenciado por una acumulación en el contenido de compuestos fenólicos totales en el tejido con respecto al control. Sin embargo, el protonema recuperó su actividad metabólica ya que no se encontraron diferencias significativas en el índice de crecimiento entre los dos tiempos de exposición y el control. También se encontró actividad antibacteriana y citotóxica contra la línea celular CHO de extractos provenientes tanto del protonema en suspensión como del musgo creciendo en condiciones naturales, siendo los más promisorios los extractos de acetato de etilo y diclorometano. Se determinó la presencia de saponinas, terpenoides y flavonoides en el tejido creciendo en suspensión y se encontraron 5 compuestos relacionados con flavonoides mediante HPLC, los cuales no pudieron ser identificados. Los resultados de este estudio confirman que es factible utilizar las suspensiones del tejido protonemal de musgos como una plataforma de producción de compuestos bioactivos, tales como sustancias antimicrobianas y anticancerígenas. Este trabajo también hace un aporte al conocimiento de este tipo de suspensiones celulares con respecto a la caracterización de su crecimiento mediante la evaluación de diferentes factores, con el fin de mejorar la bioproductividad del cultivo, como una clave para su futura aplicación biotecnológica a gran escala., Abstract: Moss protonema tissue growing in suspension has been reported as a desirable platform for recombinant protein production due to their remarkable advantages. However, studies are needed to asses its potential for the production of high-value metabolites. In this thesis, a protonema tissue culture of P. juniperinum was established for the first time and the effects of basal culture medium, trophic conditions, initial pH, inoculum size, light wavelength and mechanical disruption of tissue were evaluated in order to improve culture bioproductivity. In addition, a phytochemical analysis was performed, as well as the evaluation of antibacterial and cytotoxic activity of protonema growing in suspension, indicative of the production of bioactive compounds. P. juniperinum specific growth rate and phenolic compounds content do not significantly differed between the MS, Knop or PPNH4 culture media, even though an effect on tissue differentiation was observed. Protonema showed the ability to grow in suspension in mixotrophic and heterotrophic conditions using sucrose as a source of organic carbon, without prior adaptation of the tissue. A three-fold increase in the specific growth rate was observed under mixotrophic conditions with high cell densities (11 g/L) and simple sugars secretion to medium was evidenced during the log phase. On the other hand, this study demonstrated the tolerance of P. juniperinum protonema towards a wide range of initial pH (4.5 to 8) when grown on MS medium. An increase in the inoculum size from 45 mg/L to 300 mg/L resulted in a decrease in the growth rate under mixothrophic and photoautotrophic conditions, in contrast to heterotrophic conditions in which no differences between the different inoculum sizes were found. The use of different concentrations of sucrose did not affect the growth of the protonema, even though it had an effect on tissue differentiation, as a combined effect along with inoculum size. In addition, a variation in light wavelength was found to have remarkably effects on the growth of P. juniperinum protonema, with a significantly higher growth rate for the blue or white light spectrum, followed by the red, green or yellow spectra and darkness under photoautotrophic conditions. This change also had effects on the composition of biomass, resulting in higher contents of chlorophylls, carotenoids and total terpenoids in cultures exposed to white light and lower contents in those exposed to blue light, even though no significant differences were found regarding total phenol content between them. Finally, the mechanical disruption of the tissue (a routine activity during subculture of protonemal suspension) for 15 to 60 seconds induced a temporary oxidative burst which in turn may have a direct effect on the activation of secondary metabolism, as evidenced by the accumulation of phenolic compounds in the tissue with respect to the control. However, protonema regained its metabolic activity since no significant differences in growth rates were found between both exposure times and control. Antibacterial and cytotoxic activity of extracts from both protonema growing in suspension and field-collected moss against the CHO cell line were also found, being the most promising the ethyl acetate and dichloromethane extracts. Saponin, terpenoid and flavonoid presence was determined in tissue growing in suspension, and five flavonoid-related compounds were found by HPLC, which could not be further identified. These study results suggest the feasibility of using protonemal moss suspensions as a production platform of bioactive compounds, such as antimicrobial and anticancer substances. This work also makes a contribution to the knowledge of moss cell suspensions regarding the characterization of their growth by assessing different factors, in order to improve culture bioproductivity, as a key factor for a future large-scale biotechnological application

Tipo de documento:Tesis/trabajos de grado - Thesis (Maestría)
Colaborador / Asesor:Arias Zabala, Mario Evelio and Villalobos López, Miguel Ángel
Palabras clave:Protonema, Fotoautotrófico, Mixotrófico, Luz azul, Antibacteriana, Flavonoides, Citotóxico, Protonema, Photoautotrophic, Mixotrophic, blue LED, Antibacterial, Cytotoxic, Flavonoids
Temática:5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology
6 Tecnología (ciencias aplicadas) / Technology > 66 Ingeniería química y Tecnologías relacionadas/ Chemical engineering
Unidad administrativa:Sede Medellín > Facultad de Ciencias > Escuela de Biociencias
Código ID:50738
Enviado por : bdigital1_ med
Enviado el día :15 Febrero 2016 16:35
Ultima modificación:15 Febrero 2016 16:35
Ultima modificación:15 Febrero 2016 16:35
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