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Desarrollo de un nuevo método para el análisis del estado de metilación del gen hTERT y su asociación con la infección por el virus de papiloma humano en tejidos de pacientes con cáncer cervical invasivo

Morales Cárdenas, Mauro Nicolás (2013) Desarrollo de un nuevo método para el análisis del estado de metilación del gen hTERT y su asociación con la infección por el virus de papiloma humano en tejidos de pacientes con cáncer cervical invasivo. Maestría thesis, Universidad Nacional de Colombia.

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Resumen

El cáncer de cuello uterino es un problema de salud pública en Colombia, con una incidencia de 21.5 X 100000 mujeres al año. Se ha demostrado una fuerte relación entre la infección con el virus del papiloma humano (VPH) de alto riesgo y el desarrollo de cáncer cervical y de sus lesiones precursoras. La presencia de VPH es así, una causa necesaria pero no suficiente para el desarrollo de cáncer cervical y otros factores del virus, del huésped y del ambiente pueden estar involucrados en la oncogénesis cervical. Uno de estos factores es la enzima telomerasa, ésta ha sido asociada con procesos de inmortalización celular y que está compuesta una subunidad catalítica con actividad transcriptasa reversa, codificada por el gen hTERT, y un componente de ARN (TR o TER), que sirve como molde para sintetizar las repeticiones telomericas. Algunos estudios han sugerido que el estado de metilación del gen hTERT está asociado con la desregulación en la expresión de la proteína, además de proponer que en cáncer cervical esta alteración puede ser medida por la patogénesis del virus del papiloma humano. Sin embargo en la actualidad se sabe poco sobre el papel de la metilación del gen hTERT y su asociación con la infección por VPH en la carcinogénesis cervical. La mayoría de los ensayos usados para analizar patrones de metilación son laboriosos, poco informativos y costosos; es por ello que se requiere del desarrollo de técnicas de fácil manejo, óptimas para la obtención de esta información y que permitan analizar eficientemente grandes números de muestras. En este trabajo se desarrollo un nuevo método basado en el ensayo de línea reversa para el análisis de metilación del gen hTERT y se estableció su asociación con la infección por Virus de Papiloma Humano en tejidos de pacientes con cáncer cervical invasivo. 205 muestras de tejidos de pacientes con cáncer cervical invasivo fueron analizadas, 115 de tejidos embebidos en parafina y 90 de tejidos frescos congelados. Para establecer el estado de metilación del gen hTERT se desarrolló y valido la técnica Reverse line blot sensible a metilación la cual permite el análisis de 44 muestras y dos regiones del gen en un solo ensayo (región del promotor y primer exón). La tipificación para infecciones por VPH de alto riesgo (AR) se estableció uutilizando el ensayo PCR-GP5+/GP6+bio-Reverse Line Blot (RLB) que permite la identificación de 14 tipos de VPH-AR. 105 muestras fueron positivas para el análisis de metilación de las cuales 20 (23,2%) hacían parte del grupo de los tejidos embebidos en parafina y 85 (97,7%) de los tejidos frescos congelados. El 67% de las muestras no presento metilación, 32,4% presento metilación parcial y ninguna presento metilación completa. Al realizar el análisis de metilación por regiones se encontró que la región del primer exón presento un porcentaje de metilación más elevado (32,4%) con respecto a la región del promotor (20%), porcentajes similares se encontraron cuando se realizó el análisis por separado de tejidos frescos y tejidos embebidos en parafina. Para la tipificación del VPH 157 muestras dieron positivas de las cuales 140 (89,2%) presentaron infecciones simples y 17 (10,8%) presentaron infecciones múltiples, el VPH tipo 16 (58,6%) fue el más frecuente seguido por el VPH tipo 18 (8,6%). Se realizó el análisis de asociación con 98 muestras que fueron positivas para tipificación y para el estado de metilación del gen hTERT. Se tuvieron en cuenta dos tipos de análisis de asociación uno descriptivo debido a las bajas frecuencias de algunos tipos virales y otro estadístico que comprendió las dos especies de VPH que contienen la mayoría de tipos de AR, las especies alfa 7 y alfa 9. El VPH tipo 16 fue el más frecuente presentándose en el 59,2% de las muestras. Al igual que en el análisis de metilación, la región del primer exón presento un porcentaje de metilación mayor que la del promotor en todas las muestras que fueron positivas para el VPH-AR. Por otra parte al realizar el análisis descriptivo agrupando los tipos de VPH por especie se observó que todos los tipos pertenecientes a la especie alfa 7 presentaron un patrón de 0% de metilación en la región del promotor, contrario a lo observado en las otras especies que siempre presentaron algún porcentaje de metilación en esta misma región. Al realizar el análisis estadístico se estableció que existe una asociación significativa entre el estado no metilado de la región del promotor y las especies de VPH alfa 7 y alfa 9 (p=0,01 y 0,04). Por otra parte al realizar el análisis de asociación para el estado de metilación entre regiones del gen se encontró que existe una asociación estadísticamente significativa (p=0,005), lo que sugiere que el estado de metilación de la región del promotor influye en la metilación del primer exón. El Reverse line blot sensible a Metilación, desarrollado y validado en este trabajo permite la identificación de tres patrones de metilación en dos regiones del gen hTERT y Presenta ventajas con respecto a otras técnicas debido a su alta sensibilidad, especificidad, el costo de implementación, facilidad para su implementación y realización. Se presentó un bajo porcentaje de metilación en las dos regiones del gen analizadas debido a que estas regiones son importantes por contener sitios de unión que favorecen la transcripción y es importante mantener bajo nivel de metilación en este tipo de muestras telomerasa positivas. Además se encontró que la metilación del promotor puede influir en el comportamiento epigenético del primer exón en el gen hTERT. Por otra parte en este trabajo se observó que los tipos de VPH pertenecientes a la especie alfa 7 siempre se relacionan con un estado no metilado en la región del promotor, contrario a la especie alfa 9 que en el 95% de los tipos exhibe algún porcentaje de metilación. Lo que indica que posiblemente exista un mecanismo que asegure un estado libre de metilación en la región del promotor y este puede jugar un papel fundamental en la expresión de hTERT. Este es el primer trabajo a nivel mundial que establece una asociación entre el estado de metilación de dos regiones del gen hTERT con las especies y tipos de VPH de alto riesgo en muestras de pacientes con cáncer cervical invasivo., Abstract. Cervical cancer has an incidence of 21.5 X 100,000 women per year. It has shown a strong relationship between infection with human papillomavirus (HPV) high-risk and the development of cervical cancer and its precursor lesions. The presence of HPV is thus a necessary but not sufficient cause for the development of cervical cancer and other factors of the virus, the host and the environment may be involved in cervical oncogenesis. One of these factors is the enzyme telomerase , it has been associated with cell immortalization process and composed of a catalytic subunit with reverse transcriptase activity , encoded by the hTERT gene , and an RNA component (TR or TER) , which serves as template to synthesize the telomeric repeats . Some studies have suggested that the methylation status of the hTERT gene is associated with the deregulation of expression of the protein in addition to cervical cancer propose that this change can be mediated by the pathogenesis of human papillomavirus. But now little is known about the role of hTERT gene methylation and its association with HPV infection in cervical carcinogenesis. Most assays used to analyze methylation patterns are laborious , costly uninformative , which is why it requires the development of techniques for easy handling, optimal for obtaining this information and allow efficiently analyze large numbers of samples. In this paper we develop a new method based on reverse line assay for methylation analysis of hTERT gene and its association with the infection of Human Papilloma Virus in tissues of patients with invasive cervical cancer. Tissue samples from 205 patients with invasive cervical cancer were analyzed, 115 of paraffin embedded tissues and frozen fresh tissue 90. For Establishing the methylation state of the hTERT gene was developed and validated the technique Reverse line blot methylation sensitive which allows the analysis of 44 samples and two regions of the gene in a single assay (promoter region and first exon). Typing for HPV infections high risk (AR) was made whit PCR assay GP5 + / GP6 + bio -Reverse Line Blot (RLB) that allows the identification of 14 HR-HPV types. 105 samples were positive for methylation analysis 20 (23.2 %) were part of the group of tissues embedded in paraffin and 85 (97.7 %) of fresh-frozen tissue. The 67% of the samples presented no methylation, partial methylation 32.4% and complete methylation no present in any sample. When was performed the analyzing of methylation for regions was found that the region of the first exon present a higher percentage of methylation (32.4%) with respect to the promoter region (20%), similar percentages were found when the analysis was performed separately fresh tissue and paraffin-embedded tissues. For HPV typing positive samples were 157 of which 140 (89.2%) had single infections and 17 (10.8%) had multiple infections, HPV type 16 (58.6%) was the most frequent followed by HPV type 18 (8.6%). We performed association analysis with 98 samples that were positive for typing and for the methylation status of the hTERT gene. We considered two types of association a descriptive analysis due to the low frequency of some types of HPV and statistical that included the two species that containing HPV most types of AR, species alpha 7 and alpha 9. HPV type 16 was the most frequently appearing in 59.2 % of samples. As in the methylation analysis, the region of the first exon presents a higher percentage of methylation compared of the region promoter in all samples that were positive for HPV-AR. In addition to performing descriptive analysis of HPV types grouped by species was observed that all types belonging to the species alpha 7 showed a pattern of 0 % methylation in the promoter region, contrary to what is observed in other species always presented some percentage of methylation in this same region. By statistical analysis it was established that there is a significant association between the unmethylated state of the promoter region and species of HPV alpha 7 and alpha 9 (p=0.01 and 0.04). On the other hand when performing association analysis for the methylation status between regions of the gene was found that there is a statistically significant association (p=0.005), suggesting that the methylation status of the promoter region methylation influences first exon. Reverse line blot the methylation sensitive developed and validated allows the identification of three methylation patterns in two regions of the hTERT gene and has advantages over other techniques because of its high sensitivity, specificity, cost of implementation, ease for implementation and realization. Showed a low percentage of methylation in the two regions of the gene analyzed because these regions are important to contain binding sites that promote transcription and it is important to maintain low levels of methylation in these samples positive telomerase. In addition we found that promoter methylation can influence the behavior epigenetic of the first exon the hTERT gene. Moreover, in this study we found that HPV types belonging to the species alpha 7 are always associated with a non-methylated at the promoter region, contrary to the species alpha 9 which in 95% of the types exhibits some percentage methylation. Indicating that there may be a mechanism to ensure a free state of methylation in the promoter region and this may play a role in the expression of hTERT. This is the first study worldwide that establishes an association between the methylation status of two regions of the hTERT gene with species and types of high-risk HPV in samples from patients with invasive cervical cancer.

Tipo de documento:Tesis/trabajos de grado - Thesis (Maestría)
Colaborador / Asesor:Molano Luque, Mónica
Información adicional:Magister en Genética Humana.
Palabras clave:Telomerasa, Virus de papiloma humano, Metilación, Cáncer cervical, Gen hTERT, Telomerase, Human Papilloma Virus, Methylation, Cervical cancer
Temática:5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 51 Matemáticas / Mathematics
6 Tecnología (ciencias aplicadas) / Technology > 61 Ciencias médicas; Medicina / Medicine & health
Unidad administrativa:Sede Bogotá > Facultad de Medicina
Código ID:44106
Enviado por : Universidad Nacional de Colombia Biblioteca Digital -3- Sede Bogotá
Enviado el día :20 Oct 2014 15:58
Ultima modificación:20 Oct 2014 15:58
Ultima modificación:20 Oct 2014 15:58
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