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Clonación y determinación de la especificidad iónica de CtpA, una ATPasa tipo P encargada de transportar metales pesados a través de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis

León Torres, Andrés Felipe (2013) Clonación y determinación de la especificidad iónica de CtpA, una ATPasa tipo P encargada de transportar metales pesados a través de la membrana plasmática de Mycobacterium tuberculosis. Maestría thesis, Universidad Nacional de Colombia.

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Resumen

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa que representa uno de los mayores retos de salud pública en el mundo. Actualmente, su tratamiento no es efectivo debido al surgimiento de cepas de Mycobacterium tuberculosis (agente etiológico de la enfermedad) resistentes a los fármacos antituberculosos convencionalmente utilizados. Tradicionalmente las enzimas de la membrana plasmática se han asociado con los fenómenos de resistencia en bacterias debido que algunas de ellas se encargan del eflujo de sustancias toxicas. Entre ellas, las ATPasas tipo P1B han sido de gran interés debido a que están involucradas en el transporte de metales pesados que afectan el crecimiento celular. En el caso de algunas bacterias patógenas, algunas ATPasas tipo P1B se han considerado como posible factores de virulencia debido a su papel en la adaptación que del patógeno en el ambiente intracelular. En comparación con otros sistemas bacterianos el genoma de M. tuberculosis H37Rv (cepa de referencia) contiene un gran número de ATPasas tipo P1B. Mediante herramientas bioinformáticas ha sido posible realizar una aproximación para conocer los sustratos transportados por estas enzimas, logrando de esta forma identificar la relación de las proteínas CtpA, CtpB y CtpV con el transporte de Cu+; el de CtpC y CtpG con el transporte Zn2+; y el de CtpD y CtpJ con el transporte de Co2+. Estudios anteriores han reportado que ctpA hace parte del grupo de genes que M. tuberculosis sobreexpresa durante la infección in vivo. Específicamente se evidenció el aumento de la expresión del gen ctpA en cepas de M. tuberculosis multiresistentes y extremadamenteresistentes productoras de TB pulmonar o extrapulmonar, sugiriendo que CtpA es una enzima importante para el progreso de la infección tuberculosa. El objetivo del presente proyecto ha sido conocer la especificidad iónica de CtpA, encaminado a conocer su posible papel en la dinámica de infección tuberculosa. Los resultados obtenidos han mostrado que la sobreexpresión heteróloga de CtpA de M. tuberculosis le induce a M. smegmatis mc2155 tolerancia a niveles tóxicos de Cu2+ (4 mM). Se postula que posiblemente el Cu2+ que ingresa a la micobacteria es reducido a Cu+ debido al carácter fuertemente reductor del interior celular; además que una vez reducido el Cu sufre un eflujo al exterior de la micobacteria. Por otro lado, ensayos de actividad ATPasa mostraron que la presencia de Cu+ (4,9 U/mg de proteína) y Ni2+ (2,1 U/mg de proteína) estimula la actividad ATPasa en vesículas de membrana plasmática de M. smegmatis enriquecidas con CtpA. Finalmente, se determinaron los parámetros cinéticos de la actividad de CtpA sobreexpresanda en vesículas de membrana, encontrando que la enzima presenta condiciones óptimas de reacción enzimática a 37 °C y un pH de 7,9. Se encontró que las contantes cinéticas aparentes de CtpA son K1/2 de 4,68 x 10-2 μM de Cu+, Vmax 10,3 U/mg de proteína y h de 1,91. El conjunto de resultados obtenidos sugieren que CtpA es una Cu+ ATPasa tipo P que tiene como función desintoxicar a la célula cuando se enfrenta a niveles letales de Cu+. Adicionalmente, se construyó un sustrato de intercambio alélico y la cepa de recombinería para obtener una cepa mutante defectiva en el gen ctpA de M. tuberculosis H37Ra, mediante la técnica de recombinería, que en un futuro cercano permitirá contrastar los resultados obtenidos en el presente trabajo, y ampliar acerca del transporte de Cu+ mediado por ATPasas tipo P en M. tuberculosis H37Rv., Abstract. Tuberculosis is an infectious disease that represents a major public health challenges in the world. Currently, treatment is not effective due to the emergence of strains of Mycobacterium tuberculosis (etiologic agent of the disease) resistant to anti-tuberculosis drugs conventionally used. Traditionally, plasma membrane enzymes have been associated with the incidence of resistance in bacteria because some of them are responsible for the efflux of toxic substances. Among them, the P1B-type ATPases have been of great interest because they are involved in the transport of heavy metals that affect cell growth. In the case of some pathogenic bacteria, some P1B-type ATPases are considered as virulence factors due to its role in the adaptation of the pathogen in the intracellular environment. Compared to other bacterial systems the genome of M. tuberculosis H37Rv (reference strain) contains a large number of P1B-type ATPases. With bioinformatic tools has been possible to make an approach for substrates delivered by these enzymes, thereby achieving identify the relationship of proteins CtpA, CtpB and CtpV with Cu+ transport, the CtpC and CtpG with Zn2+ transport, and the CtpD and CtpJ with Co2+ transport. Previous studies have reported that CtpA is part of a group of genes that are overexpressed during M. tuberculosis infection in vivo. Specifically showed an expression increase of the ctpA gene in pulmonar TB and extrapulmonar TB infected with multi-drug-resistance-tuberculosis and extensively-drug-resistance-tuberculosis strains, suggesting that CtpA is an important enzyme for tuberculosis infection. The aim of this project was to determine the ionic specificity of CtpA, pointed at knowing their possible role in the dynamics of tuberculosis infection. The results have shown that M. tuberculosis CtpA heterologous overexpression induces toxic levels of Cu2+ (4 mM) tolerance to M. smegmatis mc2155. It is postulated, when the Cu2+ enters to the mycobacteria is reduced to Cu+ due to a strongly reducing environment in the cell cytosol, and then undergoes the Cu efflux outside of the mycobacteria. On the other hand, ATPase activity tests showed that the presence of Cu+ (4.9 U/mg protein) and Ni2+ (2.1 U/mg protein) stimulates ATPase activity in plasma membrane vesicles of M. smegmatis enriched with CtpA. Finally, CtpA kinetic parameters were determined, finding that the enzyme has optimum enzymatic reaction at 37 °C and a pH of 7.9. It was found that the CtpA apparent kinetic constants are K1/2 4.68 x 10-2 μM of Cu+, Vmax of 10.3 U/mg protein, and h of 1.91. The results obtained suggest that CtpA is a Cu+ P-type ATPase whose function is to detoxify the cell when it faced with lethal levels of Cu+. Additionally, an allelic exchange substrate and a M. tuberculosis H37Ra recombineering strain were constructed to obtain a mutant strain defective in the ctpA gene using the recombineering technique, which in the near future will compare the results obtained in this work, and expand on Cu+ transport mediated by P-type ATPases in M. tuberculosis H37Rv.

Tipo de documento:Tesis/trabajos de grado - Thesis (Maestría)
Colaborador / Asesor:Soto Ospina, Carlos Yesid
Información adicional:Master en Ciencias Bioquímica. Línea de Investigación: Interacción Hospedero Patógeno
Palabras clave:Mycobacterium tuberculosis, ATPasas tipo P1B, Bioinformática, Transporte iónico, Metales pesados, Clonación, Recombinería, P1B type ATPases, Bioinformatic, Ionic transport, Heavy metals, Clonation, Recombiniering
Temática:5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 54 Química y ciencias afines / Chemistry
5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology
6 Tecnología (ciencias aplicadas) / Technology > 61 Ciencias médicas; Medicina / Medicine & health
Unidad administrativa:Sede Bogotá > Facultad de Ciencias > Departamento de Química
Código ID:42971
Enviado por : Universidad Nacional de Colombia Biblioteca Digital -3- Sede Bogotá
Enviado el día :18 Septiembre 2014 19:20
Ultima modificación:18 Septiembre 2014 19:20
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