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Evaluación preliminar de la especificidad iónica de la proteína CtpH expresada en Escherichia coli: ATPasa tipo P de Mycobacterium tuberculosis

Patiño Ruiz, Miyer Fabián (2012) Evaluación preliminar de la especificidad iónica de la proteína CtpH expresada en Escherichia coli: ATPasa tipo P de Mycobacterium tuberculosis. Maestría thesis, Universidad Nacional de Colombia.

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Resumen

La búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas es una prioridad para el control de la tuberculosis. El desarrollo de agentes antituberculosos requiere del conocimiento de nuevas dianas celulares esenciales y el entendimiento de sus mecanismos de acción. Las ATPasas tipo P han sido propuestas como dianas para el diseño de compuestos antimicrobianos contra algunos patógenos humanos. El mantenimiento de los gradientes de iones esenciales a través de la membrana celular de la micobacteria hace que estas proteínas sean cruciales para la supervivencia celular. Específicamente, los gradientes del ion Ca2+ junto con otros iones como Na+, K+ y H+ controlan numerosos procesos de transporte secundarios e imponen una regulación astringente en diversas vías de señalización [Yatime, et al. 2009]. Estudios bioinformáticos del genoma de M. tuberculosis evidenciaron que existen 28 secuencias que codifican para transportadores putativos de iones metálicos, entre ellos 12 ATPasas tipo P (CtpA, CtpB, CtpC, CtpD, CtpE, CtpF, CtpG, CtpH, CtpI, CtpJ, CtpV y KdpB), las cuales han sido poco caracterizadas experimentalmente [Novoa et. al., 2012; Agranoff, D y Krishna, S., 2004, 1998]. Algunos de estos marcos de lectura también son codificados en M. leprae sugiriendo que tienen un rol a nivel intracelular, ya que este microorganismo únicamente sobrevive en el interior de las células hospederas. Este gran número de ATPasas, puede dar la versatilidad requerida al bacilo para adaptarse a los nichos intra- y extracelulares durante las diferentes etapas de la infección, las cuales difieren marcadamente en osmolaridad, concentraciones de iones metálicos, pH y disponibilidad de nutrientes. Se ha comprobado que la micobacteria necesita la acción de ATPasas tipo P transportadoras de metales pesados para su supervivencia frente al aumento en las concentraciones de Cu+ y Zn2+, mecanismo utilizado por el macrófago para intentar eliminar al bacilo [Botella, H. et al., 2011; Sarah, W., et al., 2010] . Nuestro grupo de investigación se ha enfocado en la caracterización de las ATPasas tipo P transportadoras de metales alcalinos y alcalinotérreos debido a que podrían jugar un papel vital en el control de las concentraciones intrafagosomales de Ca2+, K+ y/o Cl- cuyas variaciones han demostrado estar ligadas a la inhibición de la fusión fagosoma lisosoma [Soldati y Neyrolles, 2012]. De los 12 marcos de lectura codificantes de ATPasas tipo P presentes en el genoma de M. tuberculosis se escogió como enzima de estudio la secuencia CtpH debido no solo a su posible especificidad hacia el transporte de metales alcalinos y alcalinotérreos, sino también por la inusual presencia de un segmento largo N-terminal no encontrado en otras estructuras comunes de ATPasas tipo P. Aparentemente este segmento no esta implicado en el mecanismo de transporte y su posible función podría ser regulatoria. El presente trabajo constituye la primera aproximación experimental hacia la definición de la especificidad ionica de la proteína CtpH de M. tuberculosis mediante su expresión heteróloga en la membrana de E. coli. Ensayos bioquímicos de actividad ATPasa y medidas electrofisiológicas en vesículas de membrana mediante la técnica SSM permitieron identificar el transporte de Na+/K+ y/o Ca2+ a través de esta proteína. , Abstract. The search for new therapies is a priority for TB control. The development of antituberculosis agents requires knowledge of new essential cellular targets and understanding their mechanisms of action. P-type ATPases have been proposed as targets for the design of antimicrobial compounds against several human pathogens. Maintaining essential ion gradients across cell membrane of mycobacteria makes these proteins critical for cell survival. Specifically, the gradients of the Ca2+ ion along with other ions such as Na+, K+ and H+ control various transport processes and impose an astringent regulation in various signaling pathways [Yatime, et al. 2009]. Genome bioinformatics studies of M. tuberculosis showed that there are 28 sequences encoding putative metal ion transporters, including 12 P-type ATPases (CtpA, CtpB, CtpC, CtpD, CtpE, CtpF, CtpG, CtpH, CtpI, CtpJ, CtpV and KdpB), which have been poorly characterized experimentally [Novoa et. al., 2012; Agranoff, D and Krishna, S., 2004, 1998]. Some of these reading frames are also encoded by M. leprae suggesting that play a role at the intracellular level, as this organism survives only within host cells. This large number of ATPases might give the bacillus the required versatility to adapt to intra-and extracellular niche during different stages of infection, which differ markedly in osmolarity, metal ion concentrations, pH and nutrient availability. It has been found that the mycobacteria need heavy metal P-type ATPases for survival when facing increasing concentrations of Cu+ and Zn2+, a mechanism used by the macrophage to try to eliminate the bacillus [Botella, H. et al., 2011, Sarah, W., et al., 2010]. Our research group has focused on the characterization of the P type ATPase transporters of alkaline and alkaline earth metals because they could play a vital role in the control of intraphagosomal concentrations of Ca2+, K+ and/or Cl- whose variations have been shown to be linked to inhibiting the phagosome-lysosome fusion [Soldati and Neyrolles, 2012]. Of the 12 reading frames coding P type ATPases present in the genome of M. tuberculosis, the enzyme CtpH was chosen for study not only because of their potential specificity for transporting alkaline and alkaline earth metals, but also by the presence of an unusually large N-terminal segment not found in other common structures of P-type ATPases. Apparently this segment is not involved in the transport mechanism and its possible function might be regulatory. This work is the first experimental approach to the definition of the ionic specificity of the protein CtpH of M. tuberculosis trough heterologous expression in the membrane of E. coli. Biochemical assays of ATPase activity and electrophysiological measurements in membrane vesicles employing SSM technique allowed the identification of Na+/K+ and/or Ca2+ transport through this protein.

Tipo de documento:Tesis/trabajos de grado - Thesis (Maestría)
Colaborador / Asesor:Soto Ospina, Carlos Yesid and Castaño Valencia, Rafael Santiago
Información adicional:Magíster en Ciencias - Bioquímica
Palabras clave:Mycobacterium tuberculosis, ATPasas tipo P , CtpH, Mycobacterium tuberculosis, P type ATPases
Temática:5 Ciencias naturales y matemáticas / Science > 57 Ciencias de la vida; Biología / Life sciences; biology
6 Tecnología (ciencias aplicadas) / Technology > 61 Ciencias médicas; Medicina / Medicine & health
Unidad administrativa:Sede Bogotá > Facultad de Ciencias > Departamento de Química
Código ID:11559
Enviado por : Universidad Nacional de Colombia Biblioteca Digital -2-Sede Bogotá
Enviado el día :26 Mar 2014 14:53
Ultima modificación:26 Mar 2014 14:53
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